Innovazione industriale verso la sintesi peptidica priva di TFA

La sintesi peptidica in fase solida (SPPS) ha a lungo fatto affidamento sull’acido trifluoroacetico (TFA) come reagente standard per la deprotezione globale delle catene laterali e la scissione della resina, grazie alla sua elevata efficacia nel rompere i legami dei gruppi protettivi.

Tuttavia, le crescenti preoccupazioni relative all’impatto ambientale, la stabilità chimica e le limitazioni del processo hanno accelerato la ricerca di strategie alternative.

Il TFA è classificato come sostanza chimica persistente e è sempre più associato a pressioni normative, inclusa la proposta di restrizioni UE sulle sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS), che potrebbero includere il TFA in futuri quadri normativi.

Le principali limitazioni della SPPS basata su TFA includono:

• Fardello di solventi non riciclabili e preoccupazioni sulla sostenibilità ambientale
• Dipendenza da gruppi protettivi sensibili agli acidi
• Problemi di aggregazione causati da gruppi protettivi idrofobici (es. tBu, Boc, Trt)
• Degrado di sequenze sensibili come i peptidi N-metilati in condizioni acide forti
• Requisiti di deprotezione prolungati per gruppi come Pbf-Arg, che aumentano il rischio di scissione dello scheletro peptidico

Queste sfide hanno spinto lo sviluppo di strategie di gruppi protettivi ortogonali di prossima generazione per la sintesi peptidica in condizioni più mildi e sostenibili.

Una nuova piattaforma SPPS fotocatalitica Fmoc/Pic

Un recente studio pubblicato dal gruppo del Professor Ping Wang dell’Università Jiao Tong di Shanghai (JACS) introduce una nuova strategia di gruppi protettivi Fmoc/Pic (piridilmetile) che consente:

• Protezione ortogonale delle catene laterali
• Deprotezione guidata dalla luce visibile tramite scissione fotocatalitica del legame C–eteroatomo
• Deprotezione globale priva di acidi
• Compatibilità totale con sintetizzatori peptidici automatizzati

Questo sistema sostituisce la chimica tradizionale labile agli acidi con una piattaforma catalitica fotoredox, offrendo un’alternativa sostenibile alla sintesi peptidica basata su TFA.

Deprotezione fotocatalitica tramite chimica della luce visibile

Il metodo si basa sulla catalisi fotoredox per ottenere una scissione efficiente dei legami C–eteroatomo nei gruppi protettivi delle catene laterali degli aminoacidi.

Utilizzando la serina protetta con Fmoc/Pic come substrato modello, sono state identificate le condizioni ottimizzate:

• Sorgente di luce: lampada fluorescente compatta (CFL) da 10 W
li data-section-id="m4mxsk" data-start="2558" data-end="2594">Catalizzatore: Ru(bpy)₃Cl₂ (1,5 mol%)
• Agente riducente: Acido ascorbico (5,0 equiv.)
• Sistema solvente: PBS/MeOH (pH 5,0)

In queste condizioni, la deprotezione completa è stata raggiunta in 20 minuti con conversione quantitativa.

Le principali intuizioni meccanistiche includono:

• Reattività ottimale osservata a pH 4,0–5,0, indicando l’importanza della protonazione del piridinio
• L’irradiazione con LED blu o verde ha ridotto l’efficienza a causa di un allineamento subottimale dell’assorbimento con Ru(bpy)₃²⁺
• Catalizzatori fotoredox alternativi come l’Eosina Y hanno mostrato un potenziale redox insufficiente
• Il catalizzatore fotoredox organico 4-CzIPN ha dimostrato un’efficienza comparabile, confermando la fattibilità senza metalli

Esperimenti di controllo hanno confermato che luce, catalizzatore fotoredox e riducente sono tutti essenziali per la trasformazione.

Ampia portata di aminoacidi e compatibilità con gruppi funzionali

La piattaforma Fmoc/Pic è stata estesa con successo a un’ampia gamma di aminoacidi con progetti di gruppi protettivi adattati:

• Acido aspartico e acido glutammico: La protezione con Dmpic previene la ciclizzazione e la formazione di piroglutammato
• Arginina, Lisina, Triptofano, Istidina: Derivati modificati di Pic riducono le reazioni secondarie indesiderate
• Compatibilità con aminoacidi fosfati e aminoacidi non naturali

Importante, il sistema consente la scissione selettiva dei legami C–O, C–N e C–S in identiche condizioni mildi, mantenendo la completa compatibilità con:

• Boc
• Benzile
• Gruppi protettivi fenolici
• Funzionalità estere

Ciò rappresenta un miglioramento significativo rispetto alla chimica di deprotezione mediata da acidi tradizionale.

Confronto con la SPPS convenzionale basata su TFA

Rispetto alle strategie standard di deprotezione mediate da TFA, il sistema Fmoc/Pic offre:

• Condizioni di reazione acquose mildi
• Nessuna generazione di cationi tert-butilici reattivi
• Eliminazione di reazioni secondarie come:
  • Formazione di sulfonio
  • S-alkilazione irreversibile
  • Modifica delle catene laterali aromatiche

Notevolmente, la deprotezione di Arg(Pbf) — uno dei passaggi più challenging nella SPPS — è raggiunta rapidamente e in modo pulito in condizioni fotochimiche senza degrado dello scheletro.

Questo offre un vantaggio significativo per i peptidi contenenti residui sensibili come cisteina, tirosina e triptofano.

Compatibilità con resine e SPPS automatizzata di fotoscissione completa

Per eliminare completamente l’uso di TFA, sono state impiegate resine sensibili agli acidi come la resina amide Sieber e la resina 2-clorotrityl per la sintesi peptidica C-terminale.

Dopo l’assemblaggio del peptide, la deprotezione globale e la scissione sono state raggiunte tramite irradiazione con luce visibile.

I principali risultati includono:

• Sintesi efficiente di 9 peptidi amide C-terminali ( rese del 52–65% per peptidi bioattivi come ossitocina e terlipressina)
• Eccellente stabilità di sequenze contenenti metionina senza additivi di protezione dall’ossidazione
• Sintesi riuscita di peptidi lunghi e complessi (>40 aminoacidi) con multiple modifiche Pic
• Migliorata idrofobicità del peptide e ridotti tempi di ritenzione HPLC

Notevolmente, peptidi terapeutici challenging come:

• Calcitonina di salmone
• Pramlintide
• Peptidi frammentari della proteasi HIV-1

sono stati sintetizzati con successo con elevata efficacia e purezza.

Automazione integrata completa della SPPS fotocatalitica